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单克隆抗体的制备(一)
发布时间:2010-05-17 阅读:1538人

   抗体(Antibody,Ab)是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体的制备一般是通过免疫动物并采集抗血清的方法产生的。抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分,因为抗原分子大多含有多个不同的表位(Epitope)或称抗原决定簇(Antigenic Determinant),所以抗血清多是针对多个不同抗原表位的抗体混合物。即使是针对同一抗原决定簇的免疫血清或抗体,仍是由不同的B细胞克隆产生的异质抗体组成的。因此,免疫血清或从中分离纯化的抗体又称多克隆抗体(Polyclonal Antibody),简称多抗。由于多抗的多克隆性质,加之不同批次的抗体质量差异很大,使的多克隆抗体在许多免疫试验中不可避免的带来许多麻烦。因此,针对预定抗原制备特异性一致,亲和力均一,且能保证无限量供应的抗体是免疫学家长期梦寐以求的目标。1975年,Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交瘤细胞既可产生抗体,又可无限增殖。融合获得的杂交瘤细胞,经过筛选和克隆化等,可以最终获得抗原特异性和理化特性一致,亲和力均一,由单一杂交瘤细胞克隆产生的抗体,即单克隆抗体(Monoclonal.Antibody,McAb)。杂交瘤单克隆抗体技术的诞生,使得这一梦想得以实现。
    用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与体外培养中能无限增殖的骨髓瘤细胞融合,可形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有亲本细胞的特征,既能像骨髓瘤细胞一样在体外培养中无限地快速增殖且永生不死,又能像B淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可获得由单个细胞增殖而来的单克隆杂交瘤细胞株,该杂交瘤细胞株所产生的抗体是针对同一抗原表位的高度同质的抗体,即所谓单克隆抗体,简称单抗。这一技术上的出现,不仅为医学与生物学基础研究开创了新的纪元,也为疾病的诊断、治疗和预防提供了新的工具。与多抗相比,单抗纯度高,专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单克隆抗体技术的问世,不仅带来了免疫学领域里的一次革命,而且它在生命科学的各个领域都获得了极广泛的应用,促进了众多学科的发展。Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。这一技术建立后不久,在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等诸多技术方面得到不断地改进和完善。最早被用做细胞融合剂的仙台病毒,被后来发现融合效果更好,且避免了病毒污染问题的聚乙二醇PEG)取代,从而使这一技术得到更广泛的应用。随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14,X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成免疫球蛋白的轻链又不合成重链的变种细胞系,所以由它们产生的杂交瘤细胞株,只分泌针对预定抗原的,单一种抗体分子。此后,用于细胞融合的大鼠、人、鸡和家兔等骨髓瘤细胞系的建立,使规模化生产不同种属来源的单克隆抗体也成为可能。
    杂交瘤单克隆抗体技术在具体操作上,各实验室使用的程序不尽一致,但其制备的基本步骤基本相同,一般包括:抗原的制备、动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选、分泌抗体的检测、抗体分泌细胞的克隆化、冻存与复苏以及单克隆抗体的大量生产、纯化与鉴定等。单克隆抗体的制备与生产从抗原的准备到最后鉴定完成,前后要经过连续几个月,一系列复杂的实验,大量的繁琐工作才能最终完成。
    开展杂交瘤技术制备单抗,通常必须具备下列基本仪器设备: CO2恒温培养箱、超净工作台、超低温冰箱(-70℃)、倒置显微镜、液氮罐、离心机、恒温水浴箱、超纯水装置、精密天平或电子天平,过滤除菌和高压消毒装置与烘干箱等。所需要的主要实验用品包括:细胞培养瓶,精密刻度吸管,试管,滴管(弯头、直头),平皿,烧杯,无菌试剂瓶,注射器等,细胞培养板,无菌塑料离心管,细胞冻存管,眼科剪刀,眼科镊,细胞计数板,微量可调加样器,无菌筛网,小鼠无菌解剖盘等。此外,杂交瘤细胞的筛选、检测与鉴定仪器设备依据实验方法和实验目的不同而各异,如酶标仪,洗板机,荧光显微镜或流式细胞仪,石蜡或冰冻切片机,电泳仪,蛋白印迹转膜设备等。单抗的制备一般可以参考如下基本步骤进行操作。
   1.抗原制备
   2.动物免疫
   3.细胞融合前准备
   4.细胞融合与杂交瘤的筛选
   5.抗体的检测
   6.杂交瘤的克隆化和冻存
   7.单抗的鉴定
   8.单抗的大量生产
   9.单抗的纯化
 
一、抗原制备
    制备单抗的抗原依据使用目的的不同可简单的分为免疫原,检测原和鉴定原。免疫原从纯度上说虽不要求很高,但高纯度的抗原使得获得所需单抗的机会增加,同时可以减轻后续杂交瘤筛选与抗体鉴定的工作量。因此,原则上免疫原是越纯越好,一般可根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。抗原的来源一般来说很有限,性质多不稳定,提纯时易变性,或其免疫原性强弱差异很大,或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析,或是用于检测诊断或疾病的预防和治疗。免疫原一般只需初步提纯甚至不提纯,但抗原中成分复杂,特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时,则必须对抗原进行纯化。检测原可以与免疫抗原纯度相同,也可以是不同的纯度,这主要取决于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。鉴定原是对单克隆抗体的特异性、亲和力以及结合特性、理化特性等各种技术指标做最后确认的抗原,一般要求尽可能的纯,并保持较好的抗原活性。由于用途的不同,对鉴定原的纯化或制备方法以及来源常有特殊要求。
    一般而言,抗原的纯度不很重要,特别是免疫原性较强的抗原。而能否成功得到所需要的单克隆抗体的真正关键是免疫程序、免疫剂量和方法。正常小鼠脾脏含有能产生各种不同抗体的B淋巴细胞,一只小鼠估计能产生1~5×107种不同的抗体。因此一只正常的小白鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,只能有千万分之一的机会获得某一种特定抗体。所以为了提高得到产生某种特异性抗体的杂交瘤细胞的机会,必须加强免疫,使产生特异性抗体的B淋巴细胞大量增加,从而提高筛选阳性细胞株的几率。
   (一)抗原的准备
    选择合适的免疫方案对于细胞融合的成功并获得高质量的McAb至关重要。免疫方案一般在融合前两个月左右确立,并开始初次免疫。免疫方案应根据抗原的特性及来源的不同而定。抗原的种类繁多,包括天然的蛋白质抗原和颗粒性的细胞抗原(如细胞,细菌等)、基因重组蛋白,合成性抗原(如多肽)以及小分子半抗原等。不同的抗原免疫动物具有不同的特殊性。一般完全抗原(如天然蛋白质和基因重组蛋白),尤其是可溶性抗原,为得到高效价的抗血清,免疫动物时常需加用佐剂;合成性抗原(如多肽和小分子半抗原)等半抗原物质必需先通过人工的方法与蛋白质载体偶联成为完全抗原后,再与佐剂混合免疫动物。使用佐剂后可增加抗原的免疫原性和延长抗原在机体内存留的时间,从而改善抗原原有的免疫原性,但佐剂并不能使无抗原特性的分子具有抗原性。
   1.天然的蛋白质抗原
    就抗体制备而言,天然抗原最好。运用蛋白质等生物大分子分离纯化技术直接从生物标本中分离纯化蛋白分子用作抗原。由于抗原分子在生物样品中的含量多寡不一,对于一些含量甚微的低丰度蛋白质其所需的生物样品数量和分离纯化成本极高。生物标本特别是人体标本的获得越来越困难,又由于分离成本极高,得率极低,常常不能实现,因此,远远满足不了抗体制备对抗原的需要。除极少数的高丰度抗原仍采用此方法获得抗原外,已经很少有实验室继续使用此法。
   2.重组蛋白抗原
    运用基因重组技术,将目的蛋白基因插入表达载体,转染真核细胞或转化大肠杆菌,在诱导剂或特定的条件下,可大量地表达插入基因的蛋白,此方法也称基因工程技术。由于天然蛋白通常含量很低,有的只有几千万分之一甚或更低,而且原材料也非常难得,因此为获得足够数量的蛋白进行研究或用于治疗,常采用基因工程的方法,制备大量的重组蛋白来代替天然蛋白。
    重组蛋白由于成本低,表达量大,来源充足,已成为制备抗体所用抗原的重要来源之一。但是通过原核表达系统获得的重组蛋白,只能解决连续氨基酸表位和部分构像表位的抗原来源问题。特别是在蛋白质的剪切和翻译后修饰等方面原核表达系统与真核细胞和哺乳动物细胞有较大的差异,只能满足部分抗原的需要。而真核及哺乳动物细胞重组表达系统则可以解决抗原构像表位的问题,是抗原的最佳来源。但表达量偏低,成本过高,因此使用不广。
   3.多肽合成
    随着人类、重要动植物以及模式生物等部分生物全基因序列的解码和蛋白质组学的迅猛发展,科学家已经能很轻易的获得目的蛋白的基因和氨基酸序列。根据抗原蛋白的氨基酸序列,借助抗原表位预测分析软件,科学家也能比较准确的预测和筛选出抗原性较好的多肽片段,经人工固相合成,最终获得抗原表位的多肽片段。
    随着生物信息学技术的发展,抗原的表位分析和预测成功率已比较高,特异性也较为理想。由于多肽合成技术已十分成熟,特别是多通道多肽自动合成仪等技术的使用,使得多肽的合成效率高,成本低,产量大,来源充足,已成为抗体制备中抗原的主要来源之一。
   4.小分子半抗原
    随着对食品安全,药物残留和环境监测与保护的需要,对各种小分子半抗原单克隆抗体的制备已逐渐成为抗体制备的一个新亮点。抗生素,食品添加剂,各种激素和维生素,农药,兽药,重金属等大多属于小分子半抗原,没有免疫原性,必须与载体交联成人工合成抗原(完全抗原)才能获得免疫原性。人工合成抗原的获得涉及对小分子结构的改造、对所需载体蛋白,小分子半抗原与载体蛋白的偶联方法的选择以及人工合成抗原的分离纯化与检测鉴定等。
   (二)载体偶联
    通常所说的抗原(Antigen,Ag),多指完全抗原。完全抗原具有抗原性和免疫原性两种特性。多肽和小分子化合物等通常只具有抗原性而不具有免疫原性,必须与载体蛋白偶联才能获得免疫原性,因此被成为半抗原(Hapten)。小分子化合物或多肽片段必须运用蛋白修饰或生物标记等技术,与载体蛋白分子偶联,才能获得免疫原性而成为完全抗原用于动物的免疫。常用的交联方法有碳二亚胺法,戊二醛法,活性酯法,混合酸酐法,重氮化法,同型或异形双功能交联剂等数十种。目前用于半抗原与载体蛋白偶联的交联剂已达数百种之多。常用的载体蛋白也有数十种,但最常用的还是钥孔傶血兰蛋白(Keyhole Limpet HemocyaninKLH),牛血清白蛋白Bovine Serum Albumin, BSA),鸡卵白蛋白Ovalbumin, OVA),人血清白蛋白Human Serum Albumin, HSA)等。为提高半抗原与载体蛋白交联(也称偶联)的分子比例。当相对于BSA需要更强的免疫原性,更高的交联比例,也有用氨基化牛血清白蛋白Aminalyted Bovine Serum Albumin ABSA)也称阳离子牛血清白蛋白(Cationic Bovine Serum Albumin,C-BSA),是通过用过量的带正电的伯胺(乙二胺)修饰天然BSA制备而成。氨基化BSA基本上封闭了BSA分子上所有带负电的羧基基团,使BSA分子伯胺基的数量大大增加,从而为小分子半抗原的载体蛋白偶联提供更多的活性氨基。
 
二、动物免疫
    免疫接种是单抗制备过程中的重要环节之一,其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖,以利于细胞融合形成杂交细胞,并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的机会。单抗制备中的的动物免疫与多克隆抗体制备基本相似。只是制备单抗时应根据所使用的骨髓瘤细胞的种属来源及动物品系选用实验动物。
   1.免疫动物的选择
    兔、小鼠,大鼠,羊、马、驴,鸡、猴、豚鼠等都是常用的实验动物。在抗体的制备中,选择动物时应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、对抗体的要求以及动物个体等因素。免疫用实验动物应选适龄、健壮.最好为雄性。由于所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠,所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠,所以一般的杂交瘤单克隆抗体的制备与生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是,有时为了特殊目的而需进行种间杂交,则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定,因为染色体容易丢失。就小鼠而言,初次免疫时以6-12周龄为宜,雌性鼠则更便于操作。
   2.免疫原的制备
    用于实验动物接种的免疫原有可溶性抗原和颗粒性抗原。颗粒性抗原免疫性较强,不加佐剂也可获得很好的免疫效果。如抗原来源方便,还可以增加免疫次数,缩短间隔时间,以提高免疫效果。可溶性抗原免疫原性较弱,一般要添加佐剂以增强抗原的免疫原性和延长抗原在动物体内的存留时间。常用的佐剂有弗氏完全佐剂(Freund’s Adjuvant Complete,FAC),弗氏不完全佐剂(Freund’s Adjuvant Incomplete,FAI)。此外,用于可溶性抗原,特别是一些弱抗原的免疫方案也不断更新,如①将可溶性抗原颗粒化或固相化,一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂,提高机体的免疫应答水平,促进免疫细胞对抗原的反应性。
   接种剂量:免疫原的接种量除应考虑抗原性的强弱、分子量大小外,还应考虑免疫原的纯度,有无毒性以及动物的个体状态、免疫时间和接种途径。对于较纯的可溶性抗原,通常小鼠的首次抗原免疫剂量为50~100μg/次,大鼠为100~200μg/次,兔为100μg ~1000μg/次,合成免疫原为2 mg(半抗原约为20~200μg)。加强免疫的剂量通常为首次剂量的1/2,如需制备高特异性的抗体,可选用低剂量短程免疫法;反之,欲获得高效价的抗血清,宜采用大剂量抗原长程免疫法。
   乳化:为取得较好的免疫效果,在初次免疫时,可溶性免疫原一般需要与一定量的弗氏完全佐剂混合,经过乳化后才能用于免疫接种。所谓乳化就是用佐剂包裹抗原使之形成油包水乳剂(Water-in-oil Emulsion)。在加强免疫时,通常用不完全弗氏佐剂,也有不用佐剂而取得良好免疫效果的实例。抗原的乳化有多种方法,常用的有注射器法,乳钵研磨法,机械搅拌法和超声乳化等。抗原的乳化程度对免疫效果有较大的影响。常用的检测方法是将形成的油包水乳浊液,放一滴在水面上呈小滴状不易马上扩散就算合格。商品化的弗氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
   3.免疫程序
    免疫接种是单抗制备过程中的重要环节之一,其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖,以利于细胞融合形成杂交细胞,并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤细胞的机会。因此在设计免疫程序时,应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。现有的免疫程序中多数是参照制备多克隆抗体的方法进行的。常用的免疫途径多为体内免疫法,包括皮下注射、腹腔或静脉注射,也有采用足垫、皮内、滴鼻或点眼等方式的。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射,目前尤其推崇后者,因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。为达到最高的融合率需要有尽可能多的浆母细胞,这在最后一次加强免疫后第3-4天取脾进行融合较为适宜。有人报道采用脾内免疫法,可提高小鼠对抗原的免疫反应性,且节省时间,一般免疫3天后即可取脾进行融合。可溶性抗原免疫原性弱,一般都要加佐剂,但融合前免疫通常不加佐剂。许多实验室的结果表明,在初次免疫应答时取脾细胞与骨髓瘤细胞融合,获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体,再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。动物的免疫一般可按下述步骤操作:
       初次免疫  Ag 100~500μg加弗氏完全佐剂皮下多点注射
        │  (一般0.8~1ml 0.2ml/点)
        ↓3周后(5~7天后采血,ELISA检测抗体结果呈阳性)
     第二次免疫 剂量同上,加弗氏不完全佐剂皮下或ip
        │  (ip剂量不宜超过0.5ml)
         ↓3周后(5~7天后采血,ELISA检测抗体,效价1:1000-10000)
     第三次免疫 剂量同上,加弗氏不完全佐剂,ip
        │   (5~7天后采血,ELISA检测抗体,效价1:32000以上)
        ↓3周后
     加强免疫(融合前免疫),剂量50~500μg为宜,ip或iv
        ↓3天后
     无菌取脾,制备脾细胞,用于细胞融合
   4.抗体效价测定
    单抗的制备一般选取抗体滴度高的免疫动物进行融合。免疫动物的抗体效价测定一般在初次免疫后的15~20天或第三次免疫后的7~10天采血,分离血清之后进行。采血方式有球后静脉和断尾取血2种。抗体效价的测定方法有很多种,常见的有:
   免疫酶法(EIA法):免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术。由于它特异性强,灵敏度高,现已广泛用于抗体效价的测定已经杂交瘤的筛选和抗体鉴定。
   免疫双扩散法:这是最常用的试血方法,其具体方法是,在琼脂板的中间孔加入抗原(1mg/ml)10μl,周围孔顺时针方向加入用生理盐水或PBS稀释倍比稀释的抗血清(1:2, 1:4, 1:8,1:16,1:32和1:64。经37℃保温24h后观察结果,效价在1:8以上即可用于融合。
   环状试验:这是较为经典的效价测定方法,目前较少采用,如与20μg/ml以下的抗原于30 min内能出现“艹”的沉淀环,即测定抗体效价达1:5000以上时为合格。
此外尚有血凝法,放射免疫实验(RIA)和免疫荧光实验(IFA)等方法也常用于抗体的检测。
三 融合前准备
    细胞融合是2个或2个以上的细胞合并选出一个细胞的过程。除自然情况外,2个离体的培养细胞也可用人工的方法进行融合使之产生一个新的杂种细胞。在单抗制备中是将免疫动物的脾细胞与不分泌抗体的骨髓瘤细胞融合,生成能不断分泌特异性抗体,并能在体内外不断分裂增殖的杂交瘤细胞(Hybridoma)。细胞融合是单抗制备中的最重要的技术环节之一,导致融合失败的主要原因常常是技术上的失误。例如,供体小鼠没有免疫应答,供脾小鼠血清未检测到特异性抗体的效价。但融合失败最多的原因还是污染和实验操作。因此,融合成功的关键是实验前的准备是否充分,除了洁净无菌的环境以及熟练的无菌操作技术,还应包括以下内容:
   1.骨髓瘤细胞
    用于小鼠单克隆抗体制备的骨髓瘤细胞系应是经过选育的免疫球蛋白分泌缺陷型细胞。常见的有SP2/0-Ag14,X63-Ag8.653,NSO/1和S194/5XXO·BU·1等。骨髓瘤细胞的体外培养一般采用含10~20%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养。由于骨髓瘤细胞是半贴壁状态,很容易脱落,因此不需要胰酶等的消化处理。融合前骨髓瘤细胞的生长状态,对成功地得到杂交瘤至关重要。一般要选取处于对数生长期,外观形态良好的培养细胞进行融合。为确保用于融合的骨髓瘤细胞的生长状态和尽可能高的细胞活率,常常需要于融合前1天换液1次,次日收集细胞用于融合,台盼蓝染色活细胞计数应高于95%。取约1×107~6×107对数生长期(即培养15h~20h)的骨髓瘤细胞,于室温离心收集沉淀以无血清RPMI-1640培养液重悬。为了防止骨髓瘤细胞(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷株)变异出现返祖现象,在融合前可将培养基内加入8-氮鸟嘌呤或定期对细胞进行筛选。冻存的细胞复苏后,一般要2周左右的时间其状态才能适于融合,但是也有一些实验室用复苏不到1周的骨髓瘤细胞进行融合的。长过了的骨髓瘤细胞至少需要几天才可能恢复。骨髓瘤细胞典型的倍增时间为12-16小时,有的细胞系经进一步克隆筛选,倍增时间已不足10小时。用于单抗制备的骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系,这样不仅融合率高,也便于大量生产单克隆抗体时杂交瘤细胞在腹腔内的接种。
   饲养细胞(Feeder cells)
    在单克隆抗体的制备过程中,许多环节都需要加入饲养细胞,如:在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞都是十分必要的。在细胞融合后的选择性培养过程中,由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡,此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活,通常必须加入其他活细胞使之繁殖,这种被加入的活细胞称为饲养细胞。饲养细胞促进杂交瘤细胞增殖的机制尚不明了,一般认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子,为杂交瘤细胞提供必要的生长条件;清除死亡细胞及其碎片,也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。
    饲养细胞的来源有:小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠胸腺细胞或小鼠脾细胞,也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经射线照射后用作饲养细胞。其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便,且因具有较强的吞噬功能,可有效地清除死亡细胞及其碎片,因而使用最为普遍。经照射的成纤维细胞系可于液氮罐中长期保存,随用随复苏,因而使用也比较方便。饲养细胞一般在融合前1~2天制备,这样可使微孔板底部先铺上一层饲养细胞,同时分泌较多的细胞因子,促进杂交瘤细胞的增殖。一只小鼠可获得3~8×106腹腔巨噬细胞,所以,一只小鼠可制备2-3块96孔板的饲养细胞。若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时,细胞浓度为5×106/ml,小鼠脾细胞为1×106/ml,小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105/ml,均为100μl/孔。饲养细胞的来源可以是与骨髓瘤细胞同系的纯系小鼠。也可以是其他种类或品系的小鼠,如C57鼠,昆明小白鼠等。小鼠腹腔巨噬细胞制备实验操作步骤如下:
          Balb/c小鼠10~12周龄
      ↓
     断颈处死 浸泡于75%酒精,消毒3~5分钟
      ↓
     用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜
      ↓
     用无菌注射器或尖吸管注入8~10ml培养液
      ↓
     反复冲洗,吸出冲洗液
      ↓
     放入10ml离心管,1200转/分离心5~6分钟,弃上清
      ↓
     用20%胎牛血清(FCS)的培养液重悬,调整细胞数1×10/ml
      ↓
     加入96孔板,100μl/孔
      ↓
     放入37℃ CO2孵箱培养备用
   免疫脾细胞
    B淋巴细胞的不同发育阶段对获得阳性杂交瘤具有很大影响。有人认为处在转化时期的B淋巴细胞可能更易于融合,而实验发现免疫后7~8天,虽然是抗体产生的高峰期,但形成有活力的杂交瘤细胞的比例反而减少。故一般多于加强免疫后的第3-4天取脾做细胞融合。
    免疫脾细胞指的是免疫动物脾脏B淋巴细胞中的浆母细胞,多于最后一次加强免疫(或融合前免疫)的3-4天后取脾制备成单个细胞悬液。通常每只小鼠可得1-2.5×108个脾细胞,每只大鼠脾脏可得5-10×108脾细胞。实验中免疫脾细胞的制备操作步骤如下:
       最后一次加强免疫的Balb/c小鼠,3天后摘除眼球放血,收集血清留作阳性对照
      ↓
       断颈处死,浸泡于75%酒精中消毒3~5分钟
       ↓
       用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜,打开腹腔,分离脾脏
      ↓
       取出脾脏,用不完全RPMI-1640培养液洗一次,于无菌平皿中用注射器针芯研磨成细胞悬液
      ↓
       筛网过滤,台酚蓝染液作活细胞计数(活率>95%)。
      ↓
       放入50ml离心管,1200转/分离心8~10分钟,弃上清
      ↓
       用不完全培养液重悬,置冰水浴中备用
四、细胞融合与杂交瘤的筛选
    1.细胞融合
    在单抗的制备中是最基本,也是最重要的实验操作之一。在单抗制备中,细胞融合就是要将预定抗原免疫的脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞用物理或化学的方法使之融为一体,形成杂交瘤细胞的过程。在体外正常培养的条件下,细胞很难自发性地进行融合。一般都要通过人工的方法才能实现。促进细胞融合的方法有物理融合法,如电融合、激光融合,化学融合法,如聚乙二醇PEG)和生物融合法(如仙台病毒等)。聚乙二醇(PEG)的细胞融合率较高,避免了病毒的污染问题,且不需要特殊仪器设备,从而使这一技术得到更广泛的应用。
    聚乙二醇(PEG)在分子量为200~700时,呈无色、无臭的粘稠状液体,分子量大于1 000时,则呈乳白色蜡状固体,能溶于水、乙醇及其他许多有机溶剂,对热稳定,与许多化学药品不起反应。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为1000-4 000者,分子量小的PEG,融合效率低,毒性大;分子量过大,则粘性太大,不易操作。50%浓度,pH偏碱时融合效率最高,因此常用浓度为50%,pH7.2~8.2(用7.5%NaHCO3调整)。也有在PEG中添加其它有机溶剂的,以进一步提高细胞融合率。不同批号的PEG,即使分子量相同,但融合率却有明显差异,选用时每批都必须进行细胞毒试验后方可使用。选购时一定要买高纯度的,一般多选用供气相色谱用的高纯度PEG做融合剂。
    细胞融合的操作方法很多,常用的有转动法和离心法。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例为1~10:1不等,一般3~5:1最为常用。细胞融合实验操作流程如下:
  (1)将脾细胞与骨髓瘤细胞按5:1的比例,在50ml无菌塑料离心管内混合,用不完全培养液洗1次,1200rpm,8分钟,弃上清。
  (2)用滴管吸净残留液体,轻轻弹击离心管底,使细胞沉淀略加松动,置37℃水浴进行融合。
  ①于30秒内加入37℃预温的1ml细胞融合剂,边加边搅拌。
  ②静置作用90秒钟。
  ③加37℃预热的不完全培养液,终止融合剂的作用,每隔2分钟分别加入1ml,2ml,3ml,4ml,5ml和10ml。
  (3) 1200rpm,离心8分钟,弃上清。
(4)用20%小牛血清RPMI1640轻轻混悬。
(5)将融合后的细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板,100μl/孔,37℃、5%CO2孵箱培养。
  2.杂交瘤的筛选(HAT选择培养基
    脾细胞中除了分泌抗体的B淋巴细胞外,还有大量的T淋巴细胞、巨噬细胞、颗粒细胞和基质细胞等,是复杂的细胞混合体。而细胞融合,不论是物理法还是化学法亦或是生物法,也不论其细胞融合率的高低如何,这一过程都是随机的。也就是说,经过融合后的细胞实际是一个更为复杂的脾细胞、骨髓瘤细胞与各种融合细胞(包括脾-脾细胞、瘤-瘤细胞,T-瘤细胞)的混合体,因此,必需对杂交瘤细胞进行筛选。最常用的杂交瘤细胞筛选方法是采用HAT选择性培养基。HAT是培养基中次黄嘌呤Hypoxanthine,H),氨基喋呤Aminopterin,A)及胸腺嘧啶核苷Thymidine,T)的缩写。HAT培养基是根据嘌呤与嘧啶的生物合成途径设计的,一种专门用于分离杂交瘤细胞的特殊培养基。在这种选择性培养基中,由于骨髓瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶或胸腺嘧啶核苷激酶,所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷氨酰胺与尿苷酸单磷酸合成DNA,而这一途径又被氨基喋呤所阻断,所以未融合的骨髓瘤细胞不可避免地要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶,可以通过次黄嘌呤合成DNA,克服氨基喋呤的阻断,因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。脾淋巴细胞在这种普通培养基中也不能长期生存和增殖,一般于1-2周内也会全部死亡。因此,经过HAT培养基的筛选,最终只有杂交瘤细胞可以存活并增殖。
    HAT选择培养基可于融合当日或融合次日添加。加入HAT后的次日即可观察到骨髓瘤细胞开始死亡,融合后3-4天,镜下观察可见分裂增殖的细胞和克隆形成。经HAT选择培养基培养7~10天,未经融合的骨髓瘤细胞相继死去,而杂交瘤细胞即可逐渐长成细胞集落。停用HAT选择培养液后,不能直接使用普通培养液,必须添加HT培养基培养2-4周后才可以。当细胞集落面积超过培养孔的1/10以上时,即可用敏感的免疫学方法检测出阳性孔。
五、抗体的检测
   通过HAT选择性培养基筛选而获得的杂交瘤细胞仍是一个比较复杂的细胞混合体,其中仅有少数能分泌针对免疫原的特异性抗体的细胞克隆。因此,还必须对选择性培养基筛选获得的杂交瘤细胞的抗体分泌和产生能力进行分析和鉴定。一般在杂交瘤细胞布满孔底>1/10面积时,即可开始特异性抗体的检测,以筛选出所需要的杂交瘤细胞。或在融合后2周左右开始筛选,即把分泌所需抗体的杂交瘤细胞从细胞培养板众多的微孔中选出来,这个过程通常也称为抗体检测。
    检测抗体的方法很多,选用哪种方法通常根据所研究的抗原和实验室的具体条件而定。但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、灵敏,简便、特异、便于一次处理大量样品等特点。因为一次融合往往有几千个样品等待检测,必须在短短的几个小时内就报告结果,以便及时决定杂交瘤细胞的取舍。所以选用抗体检测方法的首要原则是快速、灵敏、特异、可靠、花费小和节省人力。一般说来,抗体的检测方法必须在细胞融合前就建立好,并解决和克服了在上述诸方面可能存在的人员与设备、技术与操作、抗原等试剂材料问题。
    另一个重要问题是抗体检测方法所需要的检测范围,即检出背景以上的最强与最弱信号之比,检测的范围通常取决于所用的检测原纯度及其含量。如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的,因为100%的抗原参与反应,一个阳性/阴性判别系统就够了。如果免疫原和检测原的纯度都不够高,则需要多个检测系统予以判别。其次,如果杂交瘤抗体是针对细胞表面的微量蛋白抗原,就可能需要所建立的检测系统能测出极微弱的反应信号,则检测范围至少应为10:1,最好为100:1。
    另外,检测方法的选择和建立还受所需单克隆抗体的类型和抗体预定用途的影响。如制备的抗体是生产检测诊断试剂用的抗体还是抗体对,是用于蛋白印迹(Western Blot,WB)分析还是石蜡切片的免疫组化分析亦或是流式细胞分析,是用于毒性或活力的中和亦或是具有封闭阻断作用的治疗性抗体等等。用检测抗体的方法,从成千上万的杂交细胞孔中筛选出可分泌指定抗体的杂交瘤细胞株,是一项复杂而繁重的任务。由于细胞培养液中的抗体浓度通常是很低的,而且传统的检测方法多是以多价抗原与多克隆抗血清相反应。杂交瘤产生的抗体则是单克隆的,所以并不是每种方法都能适用。总之,检测方法的选择和建立是决定单克隆抗体制备成败最重要的因素之一,应根据抗原的性质、抗体类型的不同以及抗体的使用目的等选择不同的筛选方法,必须遵循快速、简便、特异、灵敏、稳定可靠和高效的原则。抗体检测最常用的检测方法如下:
    1.ELISA法可用于可溶性抗原(蛋白质)及细胞和病毒等McAb的检测。
    2.RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。
    3.FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。
    4.IFA用于细胞和病毒McAb的检测。
    5.试管溶血反应检测法
    6.斑点检测法  抗红血球表面的单克隆抗体与浇灌在琼脂板的红血球结合,进而结合补体,而发生溶血斑点,对着光源用肉眼即可判定。
    7.细胞凝集实验可用于血型McAb的检测。
   在制备小分子半抗原单抗的ELISA筛选检测中,用于包被的抗原应选择与用做免疫原的人工抗原具有不同的载体蛋白的人工抗原作为检测原。如果用与免疫的人工抗原相同的载体,由于载体蛋白的干扰,将不利于挑选出所要的杂交瘤细胞。另外,这两种人工抗原除了选用不同的载体,还应选用不同的交联试剂,因为交联试剂与载体交联后也可能具有抗原性,从而影响杂交瘤细胞的筛选。
   上述方法均为一般实验室的常规方法,故具体的实验过程不再赘述。
  (未完待续)

 

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