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细胞培养技术(一)
发布时间:2010-05-17 阅读:871人

一、基本概念

高等生物都是由多种不同的组织、不同的细胞构成的整体。在整体条件下,要研究单个细胞或某一群细胞在体内(in vivo)的功能或生命活动是十分困难的,但是如果把细胞拿到体外(in vitro)进行观察和研究,则要方便得多。离体细胞必须在一定的生理条件下才能保持活性并维持一定的生理活动,特别是高等动、植物细胞,对生存条件的要求极其严格,稍有不适就会死亡。因此,要实现对活细胞的研究,必须模拟体内的生理环境,于无菌状态下,在适当的温度及酸碱度和一定的营养条件下,使从动、植物组织中分离的细胞维持其结构和功能的完整性,才能生存,并能生长和增殖。

细胞培养(Cell Culture)是一种无菌操作技术。简单地说,即是把来自机体的组织经消化或机械分散使成单个细胞,于类似体内的体外环境中生存,并不断生长、繁殖或传代,借以观察细胞的生长、繁殖、分化、发育以及衰老等生命现象。利用培养细胞还可以进行细胞工程、细胞癌变、细胞间的相互作用以及细胞对环境因素的反应等重大生命科学问题的研究。细胞培养也是研究病毒与病毒感染性疾病的防治以及疫苗的研制与生产的技术基础。细胞培养技术也因此在遗传学、细胞与分子生物学、免疫学、肿瘤学、病毒学以及病理学、环境科学等众多生命科学领域得到了广泛的应用。

培养物可以是单个细胞或细胞群,培养方式可大致分为两种:一种是群体培养(Mass Culture),将含有一定数量的细胞置于培养器皿中,细胞贴壁或悬浮生长,贴壁细胞汇合(Confluence)后形成均匀的单细胞层;另一种是克隆培养(Clonal Culture),将细胞群分散成游离的单细胞,经高度稀释后,分别加入培养器皿或微孔中,使彼此距离较远或使每孔只有1个细胞,进行单个细胞培养。各单个细胞经过分裂增殖,形成一个个的细胞集落,这种细胞集落就称为克隆(Clone)一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。

原代培养(Primary Culture)也称初代培养,是指从体内或组织中取出的细胞直接进行培养,到第一次传代的阶段,此阶段一般可持续1-4周。原代培养所获得的细胞培养物即为原代细胞。原代细胞可通过组织块培养直接长出单层细胞,也可用酶或机械方法将组织分散成单个细胞进行培养获得。在首次传代前的培养均可认为是原代培养,原代细胞一旦进行传代培养(Subculture),便改称为细胞系(Cell Line),而不再称为原代培养。原代培养最大的优点是,组织和细胞刚刚离体,生物性状尚未发生很大变化,在一定程度上能反映体内状态。特别是在细胞培养会合时,原代培养的细胞其某些特殊功能表达尤为强烈,在这个培养阶段能更好地显示其与供体组织密切相关的形态学特征。在供体来源充分、条件稳定的情况下,采用原代培养做各种实验,如药物测试、细胞的分化发育和功能等效果会更好。但应注意,原代培养的细胞是异质的。由于原代细胞来源于多种细胞组成的组织,成分比较复杂,即使全为同一类型的细胞,如上皮细胞或成纤维细胞,仍具有异质性。此外,原代细胞的相互依存性强,而独立生存能力差,因而细胞克隆形成率很低。因此,在分析细胞的生物学特性时会比较困难。其次,由于供体的个体差异以及其他一些原因,细胞群的生长效果有时也不一致。

原代培养也是建立各种细胞系(株)必经的阶段。假如原代培养能够维持几小时甚至更长,即可进行进一步筛选。有的细胞具有继续增殖能力,有的细胞类型只是存活而不会增殖;另有一些细胞只在特殊条件下被应用,此外细胞的类型与分布也会发生改变。在单层培养的情况下,细胞汇合以后,瓶底全部铺满,对密度有依赖性的细胞则由于接触抑制,生长逐渐减缓或停滞,而失去密度依赖性的细胞还会继续生长,天然或自发转化的细胞则过度生长。借助于频繁传代,保持细胞低密度生长,有利于保存细胞的正常表型(如小鼠成纤维细胞)。而自发转化则倾向于高密度的细胞过度生长。

传代(Passage)就是将一个培养瓶中的细胞转移到另外一个或多个培养瓶中进行继续培养。传代也称为传代培养。传代培养就是原代培养或连续培养形成的单层细胞,在生长汇合以后再分散,所进行的扩大培养或扩增,否则细胞会因生长空间不足或由于细胞密度过大,培养液营养枯竭,而影响细胞的生长。通常情况下,扩大培养就是传代,也就是将一瓶细胞一分为二或者一分为三进行再培养。将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个或多个培养瓶中进行连续培养,严格说来,不论稀释或扩增与否,都应称为传代或传代培养。当然,不论何时,细胞从一个培养瓶接种到另一个培养瓶时总会丢失一部分,因此,在客观上细胞必定有所稀释和扩增。

原代培养物传代成功后,则称之为细胞系(Cell Line)。细胞系的生存期若有限,则称之为有限细胞系(Finite Cell Line);已获无限增殖能力能持续生存的细胞系,称连续细胞系或无限细胞系(Infinite Cell Line)。无限细胞系大多已能永生,其染色体发生异倍化,具异倍体核型,有的可能已成为恶性细胞,因此本质上已是发生转化的细胞系。细胞获得永生性(Immortality)或恶性性(Malignancy)是衡量细胞是否发生转化的重要标志之一。无限细胞系有的只有永生性(或不死性),即仍保留接触抑制的细胞生长特性,但不具有异体接种成瘤的特性;有的则不仅具有永生性,而且获得了异体接种成瘤的特性。接触抑制(Contact Inhibition)是区分正常细胞与肿瘤细胞的重要标志之一。它是指接种细胞在培养初期数量较少,增生快;随着数量的不断增加,细胞逐渐汇合成片,细胞的运动受到抑制,增生反而减慢的现象。

培养细胞汇合成片,虽发生接触抑制,但只要营养充分,细胞仍能分裂增殖,细胞数量仍会增加。当细胞密度进一步增加,以致培养液中的营养成分不足甚至枯竭,有害的代谢产物增加而发生密度抑制(Density Inhibition),导致细胞不再增生,甚至代谢停滞。因此,所有体外培养的细胞,当生长达到一定密度后,都需要做传代处理。传代的频率或间隔时间的长短与接种细胞的数量和生物学特性以及培养液的性质有关。培养初期接种的细胞数量大,细胞的数量增加快,传代间隔时间就短。培养液中的血清含量高时,细胞增殖的速度较含量低时快。但是,培养细胞的“一代”不表示细胞分裂一次,而是指细胞从接种培养到转移扩大培养的次数。在一次传代培养中,细胞数量要经历3-6次倍增,所以传代培养可以看作是对细胞的一次扩大培养或扩增培养操作。传代代数这一概念常常容易同“增殖代数”相混淆。细胞的“一代”,仅指从细胞接种到扩大再培养的一段时间。如某一细胞系为第53代,即指该细胞系已传代53次。它与细胞“增殖代数”(细胞世代或倍增)不同,每代培养细胞,数量约能增加3~6倍,即平均分裂3-6次,由此可见,细胞代数与增殖代数相关但不同。正常细胞培养的世代数有限,如人胚成纤维细胞可传30-50代,大约相当于150-300个细胞增殖周期;而癌细胞和发生转化的细胞则能无限培养下去,所谓转化(Transformation)即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而能永生的现象。

克隆(Clone)亦称无性繁殖系或无性系,它是由同一个祖先细胞经过有丝分裂,增殖产生的遗传性状完全一致的细胞群,如单克隆抗体产生细胞。原代培养物或细胞系,通过选择或单细胞分离培养,形成由单细胞增殖形成的细胞群(克隆化),并被赋予特定的性质或标志物称为细胞株(Cell Strain)。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。如由细胞株进一步分离培养,获得与原细胞株性状不同的细胞群,则可称之为亚株(Substrain)。

二倍体细胞(Diploid Cells)是指核型呈二倍体的细胞。细胞核中的染色质在细胞进行分裂时变成染色体,于分裂中期染色体的形态结构比较标准,便于观察和研究。人类及许多高等动物的体细胞都具有二倍体核型,如人类的体细胞为46条,呈23对(2n),故属二倍体细胞。细胞体外培养条件的稳定性是相对的,经过长期的传代培养后,细胞还是可能会发生转化或恶变,失去二倍体核型,成为多倍体(Polyploid)或异倍体(Heteroploid)或其它形式的变化。一般培养的组织细胞与原二倍染色体的供体细胞的染色体数目相同或基本相同,只要2n细胞占75%或80%以上的细胞群,均可视为二倍体。几乎所有的原代正常细胞、大多数早期的传代细胞和有限细胞系都能维持二倍体细胞的性质。在正常情况下,二倍体细胞具有限生命期,故多属有限细胞系。

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