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ELISA操作流程
发布时间:2010-05-17 阅读:1141人

ELISA操作流程
 
(一)、基本操作流程
   方法一 双抗体夹心法(用于检测未知抗原的)
  1. 包被:用包被液将抗体稀释至蛋白质含量为0.5~20μg/ml,按100ul/孔加入酶标板,4℃包被过夜。
    2. 洗板:次日弃去孔内液体,在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体,加入洗涤液(约280-300ul/孔),漂洗2-3次,每次3-5min;
  3.  封闭:按200-250ul/孔加入封闭液,室温2-3小时或37℃1-2小时,也可4℃封闭过夜,然后弃去孔内封闭液;
    4.  样品处理:用洗涤液或样品稀释液将待检样品(含未知抗原)稀释至所需浓度;
    5. 标准液:用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度(定性分析可省略本步骤);
  6. 加样:按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品、阴性对照及阳性对照,室温或37℃孵育30-60min;
    7.  洗板:同步骤2;
  8. 加酶标抗体:酶标抗体的稀释按产品说明书,按50-100ul/孔加入新鲜配制的酶标抗体,室温或37℃孵育1小时;
   9.  洗板:同步骤2; 
   10. 加底物液显色:按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液,室温避光反应15~30分钟。
  11. 终止反应:于各反应孔中加入50ul的终止液。
  12. 结果判定:可于白色背景上,直接用裸眼观察结果,反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可在酶标仪上于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处测OD值。检测时以空白对照孔调零后测各孔OD值,若样品孔中的OD值大于阴性对照孔的2.1倍,即为阳性。
  方法二 间接法(用于检测未知抗体)   
  1.  包被:用包被缓冲液将已知抗原稀释至0.5~20μg/ml,按100ul/孔加入酶标板,4℃包被过夜,次日洗涤2-3次;
    2. 洗板:次日弃去孔内液体,在纸巾上轻轻扣打以吸去残留液体,加入洗涤液(约280-300ul/孔),漂洗2-3次,每次3-5min;
    3.  封闭:按200-250ul/孔加入封闭液,室温2-3小时或37℃1-2小时,也可4℃封闭过夜,然后弃去孔内封闭液;
    4.  样品处理:用洗涤液或样品稀释液将待检样品稀释致所需浓度; 
    5. 标准液:用洗涤液或样品稀释液将标准液稀释至所需浓度(定性分析可省略本步骤);
  6. 加样:按排列顺序依次加入50-100ul/孔稀释好的标准液、处理过的待检样品(含未知抗体),阴性对照及阳性对照,室温或37℃孵育30-60min;
    7.  洗板:同步骤2;
  8. 加酶标抗体:按50-100ul/孔加入新配制的酶标抗体(抗抗体),室温或37℃孵育1小时;酶标抗体的稀释按产品说明书;
    9.  洗板:同步骤2;  
   10. 加底物液显色:按100-150ul/孔加入新配制的TMB底物溶液,室温避光反应15~30分钟。
  11. 终止反应:于各反应孔中加入50ul的终止液。
  12. 结果判定:裸眼观察结果或用酶标仪测OD值,有色产物的生成量=抗体量。

(二) 、ELISA常用的四种方法
    1.直接法测定抗原
       将抗原吸附在载体表面;
       加酶标抗体,形成抗原—抗体复合物;
       加入底物;
       结果判定:有色产物的生成量=抗原量。
    2.间接法测定抗体
       将抗原吸附于固相载体表面;
       加待检抗体, 形成抗原-抗体复合物;
       加酶标抗体(抗抗体);
       加入底物;
       结果判定:有色产物的生成量=抗体量。
    3.双抗体夹心法测定抗原
       将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面;
       加抗原,形成抗原-抗体复合物;
       加抗原免疫第二种动物获得的抗体,形成抗体抗原抗体复合物;
       加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体);
       加入底物;
       结果判定:有色产物的生成量=抗原量。
    4. 竞争法测定抗原
       将抗体吸附在固相载体表面;
       加入酶标抗原和待测抗原;
       加入底物;
       结果判定:对照孔与样品孔有色产物的生成量的差与未知抗原的量成负相关。

 

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