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免疫组化操作流程
发布时间:2010-05-17 阅读:853人

(一)、仪器设备
  1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.
  2. 水浴箱
(二)、试 剂
  1. PBS缓冲液(pH7.2―7.4)
  2.抗原热修复试剂 (0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液,CB,pH6.0)
  3.0.5mol/L EDTA缓冲液(pH 8.0)
  4. 1mol/L的TBS缓冲液(pH 8.0)
  5. 酶消化液:a. 0.1%胰蛋白酶   b.0.4%胃蛋白酶
  6. 内源性过氧化化物酶阻断剂(3%甲醇―H2O2溶液)
  7. 风裱剂:a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.0–9.5)等量混合 b.  甘油和TBS(PBS)配制
  8.TBS/PBS pH 9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本; pH 7.0-7.4适合光学纤维标本
(三)、操作流程
  1、脱蜡和水化
    脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
  a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后再浸泡10分钟
  b 无水乙醇中浸泡五分钟
  c 95%乙醇中浸泡五分钟
  d 75%乙醇中浸泡五分钟
  2、抗原修复
    用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片:
  A 抗原热修复
  a 高压热修复 在沸水中加入EDTA(pH 8.0)或0.01mmol/L枸橼酸钠缓冲溶液(pH 6.0).盖上不锈钢锅盖,但不能锁定。将玻片置于金属染色加上,缓慢加压,是玻片在缓冲液中浸泡五分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10分钟后除去热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复 电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)至95℃左右,放入组织芯片加热10-15分钟。 c 微波炉加热 在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5-10分钟,反复1-2次。适用的抗原: Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin. ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein,PKC,PCNA,ras,Rb等。
   B 酶消化方法
   在抗原酶消化修复中,常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃,消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原:包括 Collagen,GFAP,Complement,Cytokeratin,C-erB-2,LCA,LN.等
   3、免疫组化染色SP法
  (1) 脱蜡、水化
  (2)PBS洗2-3次各5分钟
  (3)3% H2O2 (80%甲醇)滴加在TMA上,室温静置10分钟
  (4)PBS洗2-3次各5分钟
  (5)抗原修复
  (6)PBS洗2-3次各5分钟
  (7)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体
  (8)滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
  (9)4℃过夜后需在37℃复温45分钟
  (10)PBS洗3次每次2分钟
  (11)滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时
  (12)Ⅱ抗中可加入0.05%的 Tween-20.
  (13)PBS洗3次各5分钟
  (14)DAB显色5-10分钟,在显微镜下掌握染色程度
  (15)PBS或自来水冲洗10分钟
  (16)苏木精复染2分钟,盐酸酒精分化
  (17)自来水冲洗10-15分钟
  (18)脱水、透明、封片、镜检。
  4、SABC法
  (1) 脱蜡、水化
  (2)PBS洗2次各5分钟
  (3)用蒸馏水或PBS配制新鲜的3% H2O2,室温封闭5-10分钟,用蒸馏水洗3次
  (4)抗原修复
  (5) PBS洗5分钟 
  (6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体
  (7)滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
  (8)PBS洗3次各2分钟
  (9)滴加生物素化Ⅱ抗,20℃-37℃ 20分钟
  (10)PBS洗3次各2分钟
  (11)滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟
  (12) PBS洗4次各5分钟
  (13) DAB显色:试剂盒或自配显色剂显色
  (14)脱水、透明、封片、镜检。

 

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