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淋巴细胞转化试验
发布时间:2010-10-21 阅读:1661人

    T淋巴细胞和B淋巴细胞受到特异性抗原或非特异性有丝分裂原,如植物血凝素(PHA)、刀豆球蛋白A(ConA)细菌脂多糖(LPS)刺激后,可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行有丝分裂的淋巴母细胞,此现象称为淋巴细胞转化 (Lymphocyte Transformation)。淋巴细胞转化率的高低,在一定程度上可以反映机体的细胞和体液免疫功能的水平。因此,淋巴细胞转化试验常作为测定机体免疫功能的指标之一。
转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过渡型淋巴细胞,未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞。在正常情况下,PHA诱导的淋巴细胞转化率为60~80%,如为50~60%则偏低,50%以下则为降低。
    淋巴细胞转化试验的方法有形态学方法、3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法及MTT比色法三种。
1、形态学方法(Morphological Method)
T淋巴细胞在体外培养过程中,受有丝分裂原如植物血凝素(PHAConA)等刺激后,可转化为体积较大的母细胞,胞浆增多而深染,核增大并可见核仁,部分细胞可出现有丝分裂,计数转化细胞的百分率可反映机体的细胞免疫功能。
2、同位素掺入法(Isotope  Incorporation Method)
T淋巴细胞受PHA或特异性抗原刺激后,发生有丝分裂,细胞进入S期,此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-Thymidine Riboside,3H-TdR)或125I标记的尿嘧啶核苷(125I-Uridine Riboside,125I-UdR),可被细胞摄入而掺入DNA中。细胞转化水平越高,掺入的放射性同位素越多。于培养结束厚收集细胞,用液体闪烁计数仪测定样本细胞中的放射性活性。实验中可根据所测定细胞同位素的掺入量,判定细胞的增殖水平。
3、噻唑兰比色法(MTT Colorimetry)
噻唑兰化学名为3-(4,5二甲基-2-噻唑)-2,5二苯基溴化四唑[3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-
Diphenyltetrazoliumbromide,MTT]是一种黄色可溶性小分子盐,细胞活化增殖时线粒体中的琥珀酸脱氢酶将MTT还原为紫褐色的甲臜(fomazan)颗粒,沉积于细胞内或细胞周围,甲臜的生成量与细胞的活化增殖水平及细胞数量呈正比。甲臜经溶解后呈紫蓝色,颜色的深浅变化可用酶标仪测定并用OD值表示细胞活化与增殖的情况。MTT法虽然灵敏度低于放射性同位素掺入法,但操作简单迅速,成本低,无放射性污染。随着甲臜溶解液的改进,操作更加简便,而线性和重复性也非常好,更有利于药物高通量筛选,已有逐渐替代同位素掺入法的趋势。

附:实验方法
一、形态学方法(Morphological Method)
【主要试剂与器材】
   1.RPMI 1640完全培养液(含10%小牛血清100U/ml青霉素100μg/ml链霉素、30.0g/L谷氨酰胺,pH至7.2~7.4)。
   2.PHA(1mg/ml,溶于RPMI 1640培养液)。
   3.红细胞裂解液
   4.瑞氏染液染色或吉姆萨染液瑞氏-吉姆萨染液染色。
   5.离心机、恒温箱、计数器及显微镜等。
【操作方法】 
   1.取无菌抗凝血0.lml,加入1.8ml细胞培养液中,同时加入1 000μg/m1 PHA 0.1m1,对照管不加PHA,将细胞置37℃、5%CO2培养3d,每天摇动1次。
   2.培养结束时吸弃大部分上清液,加入红细胞裂解液3-5ml混匀,置冰水浴3-5min。
   3.2000r/min离心10min,弃上清液,留0.2ml细胞沉淀制片,迅速吹干。
   4.吉姆萨染液染色 10~20min,水洗,干燥。
   5.油镜下观察推片的头、体、尾三部分,已转化的淋巴母细胞易集中于尾部和边缘部。计数200个淋巴细胞中转化的细胞数,计算转化率。
【结果判断】
   1.淋巴母细胞的形态学标准  细胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性及核的构造与核仁的有无。
   (1)成熟的小淋巴细胞:与未经培养的小淋巴细胞大小一样,为6~8μm,核染色致密,无核仁,核与胞浆比例大,胞浆染色为轻度嗜碱性。
   (2)过渡型淋巴细胞:比小淋巴细胞大,约10~20μm,核染色致密,但出现核仁,此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。
   (3)淋巴母细胞:细胞体积增大,约20~30μm,形态不整齐,常有小突出,核变大,核质染色疏松,有核仁1~2个,胞浆变宽,常出现胞浆空泡。
   (4)其它细胞:如中性粒细胞在培养72h后,绝大部分衰变或死亡呈碎片。
   2.淋巴细胞转化率的计算
淋巴细胞转化率计算:按上述分类检查推片头、体、尾三部分,计数200个淋巴细胞,算出百分率。转化的淋巴细胞包括淋巴母细胞和过渡型淋巴细胞,未转化的淋巴细胞指的是成熟的小淋巴细胞。在正常情况下,PHA淋巴细胞转化率为60~80%,如为50~60%则偏低,50%以下则为降低。
【注意事项】
   1.培养基成分对转化率影响较大,注意其有效期。
   2.小牛血清用前需灭活。
   3.培养时要保证有足够的气体,一般10ml培养瓶内液体总量不要超过2ml。
   4.PHA剂量过大对细胞有毒性,太小不足以刺激淋巴细胞转化,试验前应先测定PHA转化反应剂量。
   5.实验中要严格无菌操作,防止污染。
二、3H-TdR掺入法(3H-TdR Incorporation Method)【主要试剂与器材】
  1.RPMI 1640培养液和PHA等  同“形态学方法”。
  2.3H-TdR工作液  取3H-TdR原液(lmCi/ml)用无菌生理盐水稀释40倍即成3H-TdR 工作液(25μCi/ml),应用时每孔加20μl。
  3.闪烁液  2,5-二苯基恶唑(PPO)5.0g、1,4-双-(5-苯基恶唑基-2)苯(POPOP)0.5g溶于1000ml二甲苯中。
  4.49型玻璃纤维滤纸、多头细胞收集器、闪烁杯、β-液体闪烁计数器。
  5.二氧化碳细胞培养箱,96孔细胞培养板等。
【操作方法】
  1.无菌取淋巴细胞,用RPMI 1640培养液调细胞浓度至1×106/ml。
  2.取上述细胞悬液加入96孔细胞培养板内,每孔100μl。每个样品加6-12孔,其中6孔为试验组,每孔加入PHA(10μg/ml)100μl,6孔为对照组,每孔加RPMI 1640培养液100μl。
  3.置37℃、5%CO2孵育40~48h,每孔加3H-TdR 20μl,继续培养6h。
  4.多头细胞收集器将每孔培养物分别收集于直径24mm的圆形玻璃纤维纸上,抽气过滤并用蒸馏水充分洗涤。
  5.将滤纸片放50℃烘干约lh后,分别将每片滤纸浸于闪烁液中,每杯3~5ml。
  6.在β-液体闪烁计数器上测定每个样品的每分钟脉冲数(cpm)值。
【结果判断】
以刺激指数(SI)判断淋巴细胞转化程度
【注意事项】
  1.3H-TdR加入的时间  细胞分裂周期中只有S期合成DNA,故应在S期加入3H-TdR,加入过早不但不被细胞摄取,反而被降解为胸腺嘧啶,不能作为合成DNA的原料。一般在培养终止前6或16h加入3H-TdR,其掺入量高。
  2.3H-TdR法影响因素较多,需准确加样,精细操作,严格控制实验条件。
  3.闪烁液一般可重复使用3~5次,重复使用前先测本底,若大于250cpm则不能再用。
  4.平行样品的孔间误差应≤20%,否则实验数据不可信。
三、MTT比色法(MTT Colorimetry)【主要试剂与器材】  
  1.细胞培养液Hank,s液、PHA等  同“形态学方法”。
  2.MTT溶液(5mg/ml经0.22μm滤膜过滤除菌),4ºC避光保存。
  3.甲臜溶解液
  4.酶联免疫检测仪、96孔细胞培养板等。
【操作方法】
  1.用密度梯度离心法(淋巴细胞分离液)分离外周血单个核细胞并用Hank‘s液洗涤2次,用含10%小牛血清RPMI 1640培养液悬浮细胞,调细胞浓度至2×106/ml。
  2.取上述细胞悬液加入96孔培养板中,每孔加 100μl,每个样品三个复孔,并设相应对照孔,对照孔加不含PHA的 1640培养液100μl,试验孔每孔加含 PHA(10μg/ml)的培养液100μl,混匀后置37℃、5%CO2孵育68h。
  3.每孔弃上清液100μl,加MTT溶液 10μl/孔,混匀后继续培养4h,培养结束时,每孔加100μl甲臜溶解液,充分溶解,置酶联免疫检测仪分别在波长 570nm和 630nm下测定A值。
【结果判断】
以刺激指数(SI)判断淋巴细胞转化程度:
【注意事项】
  1.加入甲臜溶解液后要溶解3-6h再进行测定,若来不及测定,可将未加甲臜溶解液的培养板置4℃保存,测定前取出,置室温数分钟后再加,然后依上法测定。
  2.实验过程注意无菌操作。
【应用与评价】
淋巴细胞转化试验被广泛用于测定细胞增殖活性、细胞生长因子及某些细胞毒反应。
淋巴细胞转化试验的形态学方法、3H-TdR掺入法及MTT比色法各有特点。形态学方法操作简单,能在显微镜下观察到淋巴细胞在不同时期转化的形态特征,但统计淋巴细胞转化率有差异。3H-TdR掺入法,比形态学方法更为客观、准确、重复性好。MTT比色法的最大优点是测定迅速,可用酶联免疫检测仪同时多孔测定;结果准确,与3H-TdR掺人法测得的结果相关性很好;无放射性污染;操作简单,但敏感性较3H-TdR掺入法稍差。

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