流式细胞仪(Flow cytometer,FCM) 是集现代电子物理技术、激光技术、电子计算机技术于一身的先进科学仪器,开创了荧光技术的又一个崭新的领域。近年来此项技术发展十分迅速,不断有更新换代产品出现,具有更高灵敏度、高分辨率、双激光、多参数分析的仪器不断问世,并在朝着经济实用、操作简便、小巧精制、自动化程度高的方向发展。
FCM是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒(如细菌)逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术,它能快速、精确地测量通过检测区液流中的各种粒子,如细胞、大分子、乳胶滴或其他粒子等。流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪,是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质,如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集的专用技术设备。FCM以其快速、灵活、大量、灵敏和定量的特色,广泛应用于基础研究和临床实践各个方面,包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等,在各学科领域发挥着重要的作用。
流式细胞术是一种主要是对单细胞进行定性、定量分析和分选的细胞学实验技术,以激光为激发光源,配备有关的光学检测系统来收集荧光信号以供分析。流式细胞仪检测速度之快,统计学精度之高,是其他方法无法比拟的。它可以研究一个细胞从新生到死亡发展变化,也可以研究从细胞膜到脑浆和核内物质及染色体的改变,还可以探讨不同物质之间的相互作用及调控关系;流式细胞仪还可以同时从一个细胞中测得多种参数(如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等),进行多信息高通量并行分析,为细胞生物学、分子生物学、生物医学基础与应用研究提供强而有力的技术手段。自80年代以来,流式细胞仪已广泛地应用于基础和临床医学研究,并使之成为切实可行的有效研究方法。它在免疫学、肿瘤学、细胞遗传学、病理学、放射生物学等学科中已形成了独立的学科分支。FCM可定量分析细胞表面和细胞内抗原,以及从分子水平上对细胞的核酸含量进行测定,这些参数的变化已被用于确定正常和异常细胞的分化和生长,预示各种病理状态下细胞的生物行为。
一、流式细胞仪分类
FCM仪器分为二大类。一类为台式机,自动化程度高,操作简便,易学易掌握。其特点是仪器的光路调节系统固定,可进行免疫表型分析、DNA分析、多色分析等,适用于临床和科研的常规应用,是临床用于诊断的主流机型。目前,最新的机型已可进行自动化四色分析和细胞分选,并可配备自动进样系统、分选浓缩系统、自动免疫样本制备仪和DNA样本制备仪等选配功能。另一类为大型机,其特点是可快速将所目的细胞分选出来,并且可以将单个或指定个数的细胞分选到特定的细胞培养板或其微孔中。该机型可同时选配多种波长和类型的激光器,适宜更广泛更灵活的科学研究应用。该机型具有最佳的分析灵活性和高速度分选功能,可通过Autosort进行自动化分选。除常规应用外,还可进行高分辨率的染色体分析,是大规模干细胞分选和奶牛精子分选的首选机型。
(一)流式细胞仪的工作原理
待测样本的细胞悬液,在鞘液的包围和约束下,细胞排成单列高速由流动室喷嘴喷出,形成细胞液柱。当液柱通过检测区,在入射的激光束照射下产生前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC),它们分别反映细胞的大小和颗粒度,根据这些特性可以将细胞分类。经一种或几种特殊荧光标记的样本,在激光束的激发下所产生的特定荧光,可被光学系统检测并输送到计算机进行分析,得到细胞相应的各种特性。
(二)流式细胞仪检测的细胞特性
细胞结构组成
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细胞功能
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大小
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细胞表面、胞浆、核特异性抗原
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粒度
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细胞活性
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DNA、RNA含量
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胞内细胞因子
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蛋白质含量
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激素结合位点
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钙离子、pH值、膜电位
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酶活性
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从结构上,FCM一般可分为五部分:
(1)流动室及液流驱动系统;
(2)激光光源及光束成形系统;
(3)光学系统;
(4)信号检测与存贮、显示、分析系统;
(5)细胞分选系统。
(四)流式细胞仪的主要技术指标
1. 荧光测量灵敏度
灵敏度的高低是衡量仪器检测微弱荧光信号的重要指标,一般以能检测到单个微球上最少标有FITC或PE荧光分子数目来表示,一般现在FCM均可达到<600个荧光分子。
2. 仪器的分辨率
分辨率是衡量仪器测量精度的指标,通常用变异系数CV (Coefficient of Variation)值来表示:CV=δ/μ×100%(δ是分布的标准误差,μ是分布的平均值) 如果一群含量完全相等的样本,用FCM来测量,理想的情况下CV=0,但是在整个系统检测中,会带入许多误差,其中包括样本含量本身的误差,样本在流进照射光的微量变化,再加上仪器本身的误差等。因此CV值越小则曲线分布越窄越集中,测量误差就越小,一般的FCM在最佳状态时CV值均<2%。
CV值的计算除了采用以上的计算公式外,还可以用半高峰宽来计算,半高峰宽指在峰高一半的地方量得的峰宽,它与CV值有以下的关系:CV=半高峰宽/μ ×0.4236×100% 上述公式是建立在正态分布的条件下,而实际情况所得测量数据分布常常是非对称图形,故采用半高峰宽所计算得到的CV值要明显小于前统计公式得到的CV,在实际情况中应引起注意。
3. 前向角散射光检测灵敏度
前向角散射光检测灵敏度是指能够检测到的最小颗粒大小,一般目前商品化的FCM可以测量到0.2-0.5um左右。
4. FCM分析速度
分析速度以每秒可分析的细胞数来表示,当细胞流过光束的速度超过FCM仪器响应速度时,细胞产生的荧光信号就会被丢失,这段时间称为仪器的死时间(Dead time)。死时间越短,我们就说这台仪器处理数据越快,一般可达到3000个/ 秒~6000个/ 秒左右,FACSCalibur的分析速度为10000个/ 秒,大型机已达到每秒几万个细胞。
5. FCM分选指标
分选指标主要包括:分选速度、分选纯度及分选收获率。 分选速度指每秒可提取所要细胞的个数,目前台式带分选的仪器的分选速度为300个/秒,大型机的最高分选速度可达每秒上万个细胞。分选纯度指被分选出细胞所占的百分比,一般台式机和大型机的分选纯度均可达到99%左右。分选收获率指被分出细胞与原来溶液中该细胞的百分比。通常情况下,分选纯度和收获率是互相矛盾的,纯度提高,收获率降低,反之亦然。
6. 流式细胞仪的简明操作步骤
虽然FCM的功能复杂多样,但由于采用计算机控制,操作十分简便,基本操作可简述为以下6个步骤:
1. 开机,启动程序
2. 运行软件,检查仪器状况,预设获取条件
3. 调出软件,选择计算机与流式细胞仪的信号连接
4.样品检测
5. 数据分析
6. 关机程序
(未完待续)