产品简介

EDC是一个可以与自由羧基或氨基反应的零长度交联剂。EDC首先与羧基发生反应形成O-酰基脲中间体，此中间体能迅速与氨基基团发生反应，形成酰胺键，并释放出异脲副产物。该酰基脲中间产物在水溶液中不稳定，如不能与胺发生反应将迅速水解，使羧基再生，但如能与N-羟基琥珀酰亚胺反应则生成较稳定的中间产物。在EDC的作用下，N-羟基琥珀酰亚胺与半抗原的羧基反应将其生成活性酯。该活化反应在pH 4.5-7.2时最有效。生成的活性酯中间产物在碱性或弱碱性条件下与伯胺反应，形成酰胺共价键，实现双分子的化学交联。活性酯在pH值为7-8时效率最高。为了达到最好的反应效果，通常第一次反应多在pH 5-6的缓冲液中进行，然后再在pH 7-8或以上的缓冲液中与载体分子的胺基反应，最终实现含羧基的小分子半抗原与带有胺基的载体蛋白的化学交联，从而成功实现人工合成完全抗原。

EDC半抗原交联试剂盒（EDC coupling Kit）以EDC为偶联剂，可采用单试剂或双试剂法进行半抗原与载体蛋白的化学交联。操作简单易行，反应效率高，偶联效果稳定可靠。

包装

保存

-20℃或以下温度保存。勿反复冻融或于4℃以上久置。

使用说明

本产品可用于小分子化合物及多肽等半抗原与载体蛋白的偶联，也可作为抗肿瘤药物与靶向载体的交联试剂用于靶向药物的研究。

操作流程1（单试剂一步法）

1、取出EDC和载体蛋白平衡到室温;

2、取BSA、OVA或KLH载体蛋白干粉10mg加入到600ul超纯水中，待完全溶解；

3、取半抗原（含羧基抗原肽）2-5毫克溶于100-400µl交联缓冲液后，加入到载体蛋白溶液中，搅拌混匀。

4、取EDC粉剂5毫克溶于500ul的超纯水中，混匀后立即取100-400µl，搅拌状态下加入到半抗原载体蛋白偶联缓冲液中。

5、室温避光搅拌反应2-6小时。主要如出现沉淀，应适量减少EDC的用量。

6、取透析缓冲盐,加入氯化钠18g,定容到2000ml溶解混匀；

7、使用透析、离心超滤或脱盐柱去除未反应的半抗原、交联剂和反应副产物等，

8、收集偶联物部分，置4℃或-20℃保存备用。

操作流程2（双试剂法）

1、取出EDC、NHS和载体蛋白平衡到室温；

2、取BSA、OVA或KLH载体蛋白干粉10mg加入到900ul超纯水中，待完全溶解后，加入900ul偶联缓冲液，搅拌混匀；

3、取半抗原5.0mg（含羧基小分子化合物）溶于300µl活化液中，混匀；

4、取NHS干粉5mg，溶于250ul活化液中，取150ul加入到半抗原中，溶解混匀；

5、取EDC干粉 5mg溶于250ul活化液中，混匀后立即取150ul加入到半抗原溶液中，室温避光搅拌反应6-10小时；

6、将半抗原反应液逐滴添加到载体蛋白偶联缓冲液中，在室温避光搅拌反应4-6小时；

7、取透析缓冲盐,加入氯化钠18g,定容到2000ml溶解混匀；

8、装入透析袋对透析缓冲液透析（或使用透析、离心超滤或脱盐柱）去除未反应的半抗原、交联剂和反应副产物等，换液4-6次；

9、收集偶联物部分，置4℃或-20℃保存备用。

操作流程3（双试剂二步法）

1、取出EDC、NHS和载体蛋白平衡到室温；

2、取BSA、OVA或KLH载体蛋白干粉10mg加入到600ul超纯水中，待完全溶解后，加入900ul偶联缓冲液，搅拌混匀；

3、取半抗原5.0mg（含羧基小分子化合物或抗原肽）溶于300µl活化缓冲液中，混匀；

4、取NHS干粉5mg ，溶于250ul超纯水中，混匀后立即取出150ul加入到半抗原溶液中；

5、取EDC干粉 5mg，溶于250ul超纯水中，混匀后立即取150ul加入到半抗原溶液中，室温避光搅拌反应20-30分钟；

6、将半抗原反应液逐滴添加到载体蛋白偶联缓冲液中，在室温避光搅拌反应4-6小时；

7、取透析缓冲盐,加入氯化钠18g,定容到2000ml溶解混匀；

8、装入透析袋对透析缓冲液透析（或使用透析、离心超滤或脱盐柱）去除未反应的半抗原、交联剂和反应副产物等，换液4-6次；

9、收集偶联物部分，置4℃或-20℃保存备用。

参考文献

1、Grabarek, Z. and Gergely, J. (1990).  Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters.   Anal Biochem 185:131-5.

2、Staros, J.V., et al. (1986).  Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions.  Anal Biochem 156:220-2.

3、Timkovich, R. (1977).  Detection of the stable addition of carbodiimide to proteins.  Anal Biochem 79:135-43.

4、Sehgal D1, Vijay IK. (1994).  A method for the high efficiency of water-soluble carbodiimide-mediated amidation.  Anal Biochem.  Apr;218(1):87-91.